光学显微镜是生命科学、医学科学、材料科学等领域不可缺少的研究工具,物镜是显微镜的核心部件,决定了显微成像的两个关键参数:分辨率和成像视场角(FOV)。
这两个参数相互制约。市面上的数值孔径(NA)为0.5的显微镜物镜可提供亚微米分辨率;然而,它们的成像视场通常限制在1毫米左右。2014年诺贝尔化学奖颁给了超分辨率显微镜,这是一项大大提高成像分辨率的技术。
然而,同时实现高分辨率和大视场仍是一个研究难题,近年来,跨尺度高通量成像的需求不断增长,而传统显微镜物镜无法同时实现大视场和高分辨率。
这使得大样本的高分辨率成像变得困难。通常的方法是将样本在较小的FOV内进行多次成像,然后将图像拼接在一起以形成所需的成像场。但这种方法在拼接边缘会产生伪影,成像速度较慢,无法实时观察样本的动态变化。
为了解决上述问题,介观物镜被提出,它们具有复杂的光学结构和优异的像差优化,能够实现高数值孔径和超大成像视场,大大提升了光学显微镜的成像吞吐量。
2016年,思克莱德大学首次研发出介观物镜,其数值孔径为0.47,视场为6mm,工作波长范围为400nm~700nm,被《物理世界》杂志评选为当年十大物理学突破之一,随后相关研究在国际上陆续报道。
然而,在大视场范围内优化色差极具挑战性。目前的介观物镜仅限于单一成像波段,无论是可见光还是近红外,无法满足多样化荧光成像的要求,例如单光子或双光子成像。此外,现有介观物镜的视场集中在3毫米至6毫米范围内。越来越多的应用场景要求进一步增强成像视场以实现更高的成像吞吐量。
针对目前介观物镜成像波段较窄、成像视场不够等问题,中国科学院苏州生物医学工程与技术研究所石国华研究员团队设计了一种适用于介观视场的平场复消色差物镜结构,研制出了目前国际上成像视场最大、工作波长最宽的亚微米分辨率介观物镜。
其视场直径为8毫米,数值孔径为0.5,成像波长范围为400-1000纳米,具有在可见光和近红外波长下成像的独特能力。该成果已在《光电进展》杂志上发表。
物镜由10组19片球面镜片组成,采用三组像差优化设计。
前组包括一片双合透镜和一片三合透镜,采用近似消球差设计,在达到所需NA的同时将像差降至最低。中组包括一片单透镜、一片双合透镜、一片三合透镜和两片双高斯结构的双合弯月透镜,主要校正前组的像差。后组包括两片单透镜和一片双合透镜,用于校正残余像差。
在色差优化方面,前组采用低色散玻璃来减少色差。中组的对称弯月透镜结构可补偿横向色差,三片透镜可补偿轴向色差。
后组采用折射率相近但色散相差较大的双合透镜结构,并设置较大的空气间隙来补偿色差,组合结构设计满足了像差优化要求,最终实现介观视场从可见光到近红外波段的复消色差校正。
为验证该物镜的成像性能,研究团队进行了多项性能测试,利用该物镜对分辨率测试图进行成像,测得明场分辨率为714lp/mm,荧光微球分辨率为0.74μm,场畸变为0.46%。
在对小鼠脑和肾切片进行成像时,获得了每帧13.5亿像素的图像。与商用20x0.5NA物镜的定量比较表明,介观物镜具有相似的图像质量,但成像场面积是商用物镜的40倍以上。
为验证物镜的扫描成像能力,团队搭建了激光点扫描介观成像系统,获得了488nm连续光激发的单光子荧光成像结果和920nm飞秒脉冲光激发的双光子荧光成像结果。
单光子成像信号强度更高,双光子成像成像对比度更高,这也是首次利用介观物镜同时实现单、双光子成像。
该目标对于大规模样本的高分辨率成像具有巨大潜力,例如脑映射、跨脑区域单光子和双光子成像以及类器官的高分辨率成像。